Справочник врача 21

Поиск по медицинской литературе


Антиген и антитело




Т. Флейшер, Д. Грейси Прогресс в области экспериментальной и клинической иммунологии позволил разработать множество методов лабораторной диагностики, основанных на применении антител. Эти методы применяются в диагностике иммунодефицитов, аутоиммунных и аллергических заболеваний, злокачественных новообразований. В этой главе даны общие представления о методах исследования иммуноглобулинов, лимфоцитов, нейтрофилов, комплемента и методах диагностики аллергических заболеваний. I. Качественные и количественные методы определения IgA, IgG и IgM. Иммуноглобулины — это гликопротеиды, секретируемые плазматическими клетками. Выработка антител происходит, как правило, после антигенной стимуляции. Большинство антигенов вызывают одновременную стимуляцию нескольких клонов Bлимфоцитов — поликлональная стимуляция. Антитела, вырабатываемые одним клоном B-лимфоцитов, — моноклональные антитела — полностью идентичны. Между антителами, которые вырабатываются разными клонами B-лимфоцитов, всегда есть какие-либо различия, например в строении участка связывания с антигеном или силе связывания с антигеном. Известны 5 классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. В основе строения молекулы иммуноглобулина любого класса лежит Y-образная структура, состоящая из 2 тяжелых и 2 легких цепей, соединенных дисульфидными мостиками (см. гл. 1, п. IV.А.4). «Ветви» молекулы (Fab-фрагмент) служат для связывания антигена, а «ствол» (Fc-фрагмент) выполняет другие биологические функции: активирует комплемент, связывается с клеточной мембраной и т. д. IgG присутствуют в биологических жидкостях в виде мономеров. Они составляют большую часть иммуноглобулинов сыворотки и являются основным классом иммуноглобулинов, вырабатываемых при вторичном иммунном ответе. IgE, также мономерные, участвуют в аллергических реакциях немедленного типа. IgD находятся в основном на мембранах B-лимфоцитов и выполняют роль антигенраспознающих рецепторов, в сыворотке присутствуют в незначительном количестве в виде мономеров. IgA содержатся в сыворотке преимущественно в виде мономеров, в секрете слизистых и молозиве — в виде димеров, содержащих также J-цепь и секреторный компонент, который синтезируется в эпителии слизистых. Димерный IgA соединяется с секреторным компонентом, проходя через эпителий на поверхность слизистой. IgM присутствуют в сыворотке преимущественно в виде пентамеров. Они составляют основную долю иммуноглобулинов, вырабатываемых при первичном иммунном ответе. Методы исследования иммуноглобулинов включают в себя определение уровня иммуноглобулинов разных классов и подклассов и антител к определенным антигенам. При оценке результатов исследования необходимо учитывать, что уровень иммуноглобулинов зависит от возраста (см. приложения IV и V). Изменение уровня иммуноглобулинов в сыворотке может быть следствием нарушения их синтеза, катаболизма или выведения. А. Электрофорез 1. Зональный электрофорез — полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда. Суть метода заключается в следующем: исследуемую смесь белков на носителе (например, пластине с гелем) помещают в камеру для электрофореза, заполненную буферным раствором и подключенную к источнику постоянного тока. При электрофорезе белков сыворотки обычно получается 5 основных полос, которые соответствуют фракциям альбумина, альфа1-, альфа2-, бета- и гамма-глобулинов (см. рис. 20.1). Иммуноглобулины мигрируют преимущественно во фракцию гамма-глобулинов, хотя также присутствуют во фракциях бета- и альфа2-глобулинов. Относительное содержание каждой фракции сывороточных белков можно оценить с помощью денситометра. С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например СМЖ и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела, хотя он недостаточно чувствителен для определения моноклональных антител в низкой концентрации на ранних стадиях миеломной болезни. 2. Иммуноэлектрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) проводят электрофоретическое разделение белков в геле; 2) по окончании электрофореза в геле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки; 3) в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым (альфа, дельта, эпсилон, гамма, мю) или легким (лямбда, каппа) цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации (см. рис. 20.2). Иммуноэлектрофорез позволяет оценить лишь качественный состав исследуемой смеси белков. Оценка результатов исследования требует высокой квалификации. Чаще всего этот метод применяется для выявления и характеристики моноклональных антител. 3. Электрофорез с иммунофиксацией. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов. При связывании белков с антителами образуются иммунные комплексы, которые можно увидеть после окрашивания (см. рис. 20.3). Иммунные комплексы, содержащие нормальные иммуноглобулины, откладываются в виде широкой, размытой полосы, моноклональные — в виде более узкой и четко очерченной. Этот метод также является качественным, однако более чувствителен и прост, чем иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммунофиксацией часто применяется в сочетании с иммуноэлектрофорезом для определения моноклональных или олигоклональных иммуноглобулинов. Б. Двойная радиальная иммунодиффузия — полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее — антигены); 2) антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу; 3) в том месте, где произошло связывание антител и антигенов,... [стр. 198 ⇒]

По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам (см. гл. 15, п. II.Д.2). Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований. В. Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие — стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, C3, C4, фактора B) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации — не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты. Г. Нефелометрия — определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов. Д. РИА. Этот высокочувствительный метод разработан более 30 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами (см. рис. 20.4). Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке (см. гл. 20, п. I.Е). Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами. Е. Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген—антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора (см. рис. 20.5). Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически — по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену (см. рис. 20.5). Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с РИА, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG). Ж. Иммуноблоттинг — качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем — с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время... [стр. 199 ⇒]

Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе. В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе. 1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата. Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена. 2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации (см. гл. 20, пп. I.Б—В). а. Простая радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов. б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена. 3. Электрофорез а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А). б. Встречный электрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний. Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки. 1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C. 2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях. Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана. Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е). [стр. 211 ⇒]

При нормальных обстоятельствах защита организма происходит в упорядоченной последовательности развития всех этих фаз, сопровождается хорошо контролируемыми иммунными и воспалительными реакциями, защищающими хозяина от чужеродного антигена. Нарушение регуляции в любой из, систем защиты хозяина может привести к повреждениям ткани организма и клинически проявляющемуся заболеванию. Образование"иммунных комплексов (реакция типа I I I ) . Клиренс антигена в результате образования иммунных комплексов между антигеном и антителом представляется чрезвычайно эффективным механизмом защиты хозяина. Однако способность вызывать или не вызывать повреждающее действие на чужеродные клетки или ткани хозяина находится в зависимости от уровня образования иммунных комплексов и их физико-химических свойств. После взаимодействия с антигеном некоторые виды растворимых комплексов антиген — антитело свободно циркулируют в крови и, если они не подвергаются клиренсу ретикулоэндотелиальной системой, откладываются на стенках кровеносных сосудов, в почечных клубочках или в других тканях организма. Сущность механизмов, способствующих повреждению иммунными комплексами тканей, особенно кровеносных сосудов, подробно изложена в гл. 261 и 269. IgE-опосредуемые аллергические реакции и анафилаксия (тип I ) . Тучные клетки и базофилы несут на своей поверхности рецепторы для Fc-фрагмента IgE и присоединяемый к клеткам IgE эффективным образом «армирует» («вооружает») базофилы. Высвобождение медиаторов из базофилов стимулируется взаимодействием антигена со связанным через Fc-рецепторы IgE; высвобождающиеся медиаторы ответственны за патофизиологические изменения, наблюдаемые при аллергических заболеваниях (см. табл. 62-2). Медиаторы, продуцируемые тучными клетками, можно подразделить на три большие категории в зависимости от вызываемых ими эффектов. 1. Вызывающие увеличение проницаемости сосудов и сократительной способности гладких мышц (гистамин, SRS-A, ВК-А). 2. Вызывающие хемотаксис или активацию других воспалительных клеток (ECF-A, NCF, лейкотриен В4). 3. Вызывающие модуляцию высвобождения других медиаторов (ВК-А, тромбоцитактивирующий фактор). Цитотоксические реакции антител (тип I I ) . Для этого типа иммунологического повреждения характерно присоединение комплементфиксирующих (С1связывающие) антител против нормальных или чужеродных тканей или клеток (IgM, IgGI, IgG2, IgG3) к комплементу по классическому пути и инициирование цепи последовательных событий аналогично тому, что происходит при отложении иммунных комплексов, в результате чего происходит лизис клеток или повреждение ткани. В качестве примеров антителоопосредованных цитотоксических реакций типа II можно назвать лизис эритроцитов при трансфузионных реакциях, синдром Гудпасчера с образованием антител против базальных мембран почечных клубочков и, возможно, ювенильный сахарный диабет с продукцией антител к клеткам островков Лангерганса. Классические реакции гиперчувствительности замедленного типа (тип IV). Воспалительные реакции, инициируемые не только антителами, но и мононуклеарными лейкоцитами, получили название реакций замедленной гиперчувствительности. В отличие от реакции немедленной гиперчувствительности, обычно наблюдаемой через 10--12 ч после встречи с антигеном и инициируемой высвобождением медиаторов из базофилов или преформированными антителами, реакция замедленной гиперчувствительности характеризуется наличием вторичного клеточного ответа, возникающего через 48—72 ч после контакта с антигеном. Например, если человеку, который в прошлом был инфицирован микроорганизмами Mycobacterium tuberculosis, внутрикожно ввести очищенный туберкулезный белок (PPD), то через 48—72 ч в месте инъекции образуется зона индурации, что можно рассматривать как свидетельство прошлого контакта организма с микобактсриями туберкулеза. В этих процессах, приводящих к развитию классических реакций замедленной гиперчувствительности, принимают участие Т-клетки, их растворимые продукты и макрофаги.. Как следует из при241... [стр. 241 ⇒]

Плазменные антигены в практической трансфузиологии не учитываются. В крови человека имеются постоянные врождённые антитела (агглютинины α и β), все остальные антитела непостоянны - они могут быть приобретёнными, образовываться в организме в ответ на поступление разных антигенов (например, Rh-фактора) - это изоиммунные антитела. Антигены относятся к холодовым антителам, их специфическое действие (агглютинация) проявляется при комнатной температуре; изоиммунные антитела (например, анти-резус)- тепловые, они проявляют своё действие при температуре тела. Взаимодействие антиген-антитело проходит две стадии (фазы). В первую фазу антитела фиксируются на клетке крови и вызывают склеивание форменных элементов (агглютинация). Присоединение к антиген-антителу комплимента плазмы приводит к образованию комплекса антиген-антитело-комплимент, который лизирует мембрану клеток (эритроцитов), происходит гемолиз. Антигены крови при трансфузии могут быть причиной её иммунологической несовместимости. Основную роль в этом играют антигены системы АВ0 и Rh-фактор. Если в крови реципиента, которому переливают кровь, встречаются одноимённые антиген, находящийся в эритроцитах, и антитела, находящиеся в плазме, то происходит агглютинация эритроцитов. То же возможно при одноимённых антигенах и антителах (А и α, В и β), а также Rh-антигене и антирезусных антителах. Для такой реакции должно быть достаточное количество (титр) антител в сыворотке крови. На этом принципе основано правило Оттенберга, которое гласит, что агглютинируются эритроциты переливаемой донорской крови, так как агглютинины последней разводятся кровью реципиента и их концентрация не достигает уровня, при котором они могут агглютинировать эритроциты реципиента. По этому правилу всем реципиентам можно переливать кровь 0(I) группы, так как она не содержит агглютиногенов. Реципиентам АВ(IV) группы можно переливать кровь других групп, поскольку она не содержит агглютининов (универсальный реципиент). Однако при переливании большого количества крови (в частности, при массивной кровопотере) поступающие в организм агглютинины переливаемой иногруппной крови могут агглютинировать эритроциты крови хозяина. В связи с этим правило Оттенберга применимо при переливании до 500 мл донорской крови. Первое переливание резус-положительной крови резус-отрицательному реципиенту, не сенсибилизированному ранее, может протекать без явлений несовместимости, но приведёт к образованию антител. Переливание резус-отрицательной женщине, сенсибилизированной во время беременности резус-положительным плодом, приведёт к резус-несовместимости. При переливании резус-отрицательной крови резусположительным реципиентам не исключается выработка антител на слабые антигены системы Rh-фактора, содержащиеся в переливаемой крови. Лица с резус-отрицательной кровью одновременно являются положительными по Rhантигену, это следует учитывать при переливании резус-отрицательной крови резусположительному реципиенту, так как можно вызвать сенсибилизацию реципиента и создать опасность посттрансфузионных осложнений, если реципиент резусотрицательный. В связи с этим для переливания следует использовать кровь, строго одноимённую по Rh-фактору, с учётом пробы на резус-совместимость крови донора и реципиента. Переливание плазмы проводят с учётом групповой (АВ0) принадлежности крови. В экстремальных ситуациях возможно переливание плазмы АВ(IV) всем реципиентам, 139... [стр. 140 ⇒]

Для белков может развиться также низкодозная толерантность. Одно из важных свойств антигенов, способствующих индукции толерантности, — способность избегать поглощения АПК (например, отсутствие молекулярных агрегатов). Проявлению толерогенности способствует также относительно низкая молекулярная масса и высокая эпитопная плотность. Таким образом, одни и те же молекулы могут выступать в качестве иммуногенов и толерогенов или не оказывать действия на иммунную систему в зависимости от их физического состояния (степени агрегированности). Имеет значение также присутствие в микроокружении цитокинов, регулирующих активность дендритных клеток, обрабатывающих и презентирующих антиген Т-лимфоцитам: IL-12 и IFNγ способствуют проявлению иммуногенности, а IL-10 — толерогенности молекул антигенов. Очень важную роль играет степень экспрессии на поверхности дендритных клеток костимулирующих молекул (что, в свою очередь, зависит от наличия PAMP в молекуле антигена) — анергия развивается при слабой экспрессии этих молекул. 3.2.1.3. Специфичность антигенов В иммунологии под специфичностью понимают избирательность взаимодействия индукторов и продуктов иммунных процессов, в частности, антигенов и антител. Выше, при рассмотрении структуры антигенраспознающих рецепторов и антител (см. раздел 3.1.1.2) упоминалось, что их сродство к антигенам и способность взаимодействовать с ними связана с четко ограниченным участком — активным центром или антигенсвязывающим участком. Антигенные детерминанты Специфическое взаимодействие антител с молекулой антигена связано с относительно небольшим участком ее поверхности, соответствующим по размеру антигенсвязывающему участку рецепторов и антител. Как уже упоминалось, при изучении иммунного ответа на конъюгаты гаптенов с белками-носителями было установлено, что специфичность конъюгата определяют молекулы гаптена, к которым направлены образующиеся антитела. Связь специфичности антигенов с относительно небольшими участками ее поверхности подтвердилась при анализе специфичности природных молекул белков и полисахаридов, а также при изучении ответа на синтетические полипептиды. В этих работах было установлено, что практически в любой молекуле антигена есть несколько детерминант, или эпитопов — участков, ответственных за взаимодействие с активными центрами антигенраспознающих молекул. Для антигенов с повторяющейся структурой (например, полисахаридов) характерны повторяющиеся однотипные эпитопы. Белкам свойственны разнообразные по своей структуре эпитопы, к каждому из которых могут вырабатываться специфические антитела. В молекуле устанавливается иерархия эпитопов, когда один из них является доминирующим, что проявляется в преимущественном образовании антител против этого эпитопа (явление иммунодоминантности). После искусственного удаления этого эпитопа свойство иммунодоминантности переходит к другому эпитопу. [стр. 269 ⇒]

Расположение частей конформационных детерминант на большом расстоянии в линейной структуре молекулы описано, например, для аллотипических детерминант иммуноглобулинов, уже упоминавшихся эпитопов миоглобина и т.д. Как в линейных, так и в конформационных эпитопах роль отдельных остатков может существенно варьировать. Так, в формировании описанной выше петлевой детерминанты лизоцима ключевую роль играет остаток в положении 68. В данном случае проявляется фактор гибкости эпитопа, позволяющий «подогнать» конфигурацию конформационного эпитопа, к структуре активного центра антител. Подгонка происходит за счет остатков, обеспечивающих эту гибкость (например, пролина). Важным и практически неизученным остается вопрос об активных факторах, определяющих иерархию эпитопов и реализуемых через ингибирование одними эпитопами иммунного ответа на другие эпитопы, что может происходить с участием регуляторных клеток. Несмотря на то, что знания о структурных основах конформационных и линейных эпитопов белков пока далеко не полны, их достаточно, чтобы с высокой долей уверенности прогнозировать, какие участки белковой молекулы окажутся антигенными эпитопами. С помощью биоинформатики с использованием компьютерных программ разработаны алгоритмы для таких расчетов. В первую очередь выбирают участки с преобладанием гидрофильных остатков над гидрофобными (условие локализации эпитопа на поверхности молекулы), а также с аминокислотными остатками, придающими этому участку гибкость. Детерминанты, смоделированные на основе таких расчетов, в настоящее время синтезируют и с успехом применяют в серодиагностике и для приготовления искусственных вакцин. 3.2.1.4. Взаимодействие антигенов и антител Физико-химические основы взаимодействия антиген–антитело В основе реакции антиген–антитело лежит взаимодействие между эпитопом антигена и активным центром антитела, основанное на их пространственном соответствии (комплементарности). Это взаимодействие состоит в установлении между эпитопом и активным центром антитела нековалентных химических связей, в основе которых лежат следующие типы межмолекулярных взаимодействий (ни одно из них не является специфичным для реакции антиген–антитело) (рис. 3.25): – электростатические; они включают ионные (между заряженными группами аминокислотных остатков, например, карбоксильными и аминогруппами) и полярные (связанные с формированием диполей) взаимодействия; – водородные (связаны с формированием водородных мостиков между гидрофильными группами); – гидрофобные (обусловлены энергетическими преимуществами контакта гидрофобных участков молекул между собой); – силы Ван-дер-Ваальса (основаны на взаимодействии электронных облаков). [стр. 274 ⇒]

Константа связывания служит мерой сродства (аффинности) антител и может рассматриваться как показатель специфичности антител к данному эпитопу. Для прямого экспериментального определения аффинности антител используют метод равновесного диализа. Антитела помещают в диализационный мешок, стенки которого проницаемы для гаптена, но не для антител. Диализный мешок с антителами помещают в раствор гаптена, который начинает диффундировать в мешок по градиенту концентрации. После установления равновесия измеряют концентрацию гаптена внутри и снаружи мешка. Превышение первой величины над второй соответствует количеству гаптена, связавшегося с антителами. Результаты выражают в координатах Скэтчарда, используемых при количественной оценке параметров связывания различных веществ (например, лекарственных средств и их рецепторов). Это позволяет рассчитать величину Ка, т.е. оценить аффинность взаимодействия. Помимо кинетического подхода к оценке аффинности существует термодинамический подход, основанный на анализе изменений свободной энергии при взаимодействии антиген–антитело. Аффинность антител существенно меняется в ходе иммунного ответа («созревание аффинности» — см. раздел 3.6.2.2). При этом она возрастает от 10-7–10-8 М до 10 -10 –10 -11 М. При использовании высокомолекулярных антигенов, содержащих большое число эпитопов, точное определение аффинности взаимодействия каждого эпитопа со своим антителом становится невозможным. В этом случае оценивают суммарное сродство (функциональную аффинность, или авидность). Его определяют чаще всего по устойчивости иммунных комплексов к таким воздействиям, как повышение ионной силы раствора, способствующее разрыву связей между эпитопами и активными центрами антител. Оценку проводят с помощью иммуноферментного или радиоиммунного тестов. Как правило, авидность взаимодействия с антителами целого антигена выше, чем сумма взаимодействий с антителами индивидуальных эпитопов. Это превышение объясняют тем, что диссоциация каждой связи затрудняется при сохранении контакта молекул, удерживаемых за счет других связей. Существует значительная трудность в определении аффинности поликлоналных антител в иммунных сыворотках из-за высокой степени их гетерогенности. Эту проблему можно решить, используя моноклональные антитела — антитела с идентичной аффинностью (получают, как правило, в культурах гибридных клеток). Методы оценки взаимодействия антиген–антитело Часто возникает необходимость измерения взаимодействия антигена и антитела — как для определения содержания антител, так и для выявления антигенов в биологических жидкостях и растворах. Для этого применяют 2 группы методов. Первая группа основана на непосредственной регистрации связывания антигенов и антител. Для этого один из компонентов (обычно антитела) метят и затем выявляют связывание меченного реагента с другим компонентом реакции. В качестве метки используют радиоактивные изотопы (радионуклиды), ферменты и флуоресцентные красители (флуорохромы). Методы соответственно обозначают как радиоиммунные,... [стр. 276 ⇒]

Размер решетки и объем преципитата увеличивается с возрастанием относительной доли антител в растворе. Однако добавление антител вскоре после достижения точки эквивалентности приводит к «блокаде» молекулы антигена, когда обе валентности нескольких молекул антитела оказываются связанными с одной молекулой антигена. Это препятствует формированию решетки и сопровождается образованием растворимых иммунных комплексов состава АГ4 АТ3, АГ3АТ2 и АГ2 АТ. В настоящее время методы, основанные на преципитации, продолжают использовать в лабораторной и исследовательской практике. Реакцию преципитации в агаре применяют для определения концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови (метод радиальной иммунодиффузии). Преципитация лежит в основе широко используемого метода иммуноблоттинга («иммунопромокания»), когда электрофоретические фракции белков переносят в целлюлозу и «проявляют», осаждая антителами. Два других традиционных подхода к определению антител или выявлению антигенов основаны на агглютинации и лизисе. Сущность агглютинации состоит в склеивании частиц (эритроцитов, частиц латекса и и т.д.), несущих антиген, в присутствии антител. Антитела вызывают перекрестное связывание молекул антигена, находящихся на разных частицах, что приводит к их склеиванию. В результате стабильность суспензии частиц, поддерживаемая их взаимным электростатическим отталкиванием, нарушается и образуются агрегаты, обнаруживаемые визуально. В реакциях иммунного гемолиза, помимо антигенов и антител, участвует комплемент, обусловливающий лизис связавших антитела эритроцитов. Аналогичный подход лежит в основе метода лимфоцитотоксичности. Результаты этого метода оценивают по снижению жизнеспособности лимфоцитов, связавших антитела, в присутствии комплемента; гибель клеток выявляют по окрашиваемости витальными красителями (эозин, трипановый синий). Реакции, основанные на агглютинации и гемолизе, в настоящее время применяют в ограниченных масштабах (для экспрессной полуколичественной оценки содержания антител или антигенов). 3.2.2. Главный комплекс гистосовместимости и антигены, распознаваемые Т-клетками Решение проблемы распознавания антигенов Т-клетками потребовало значительных усилий. Уже при анализе распознавания конъюгатов гаптенов с белками-носителями было установлено, что В- и Т-клетки узнают разные эпитопы конъюгата: В-клетки распознают гаптены, а Т-клетки — детерминанты белка-носителя. Вскоре было обнаружено еще более кардинальное различие в распознавании антигенов, осуществляемом Т- и В-лимфоцитами. Оказалось, что, в отличие от В-клеток, распознающих антиген как в свободной форме (в растворе), так и на поверхности клеточных мембран, Т-клетки распознают только мембраносвязанный антиген. Более того, благодаря исследованиям Р. Цинкернагеля (R.M. Zinkernagel) и П. Догерти (P.C. Dogherty), проведенным в 70-е годы прошлого века, стало ясно, что Т-клетки распознают не столько «чужое», сколько «измененное свое». На протяжении последующих десятилетий было установлено, что... [стр. 279 ⇒]

...е. участки антигена, в которых особенно часто происходит взаимодействие с антителами. Именно эти кластеры ближе всего к тому, что принято называть антигенными детерминантами. Важно иметь в виду, что на поверхности антигена может находиться несколько антигенных детерминант различной структуры. Моноклональные антитела, реагирующие с одной детерминантой данного антигена, не будут реагировать с другими, если конечно молекула антигена не имеет осей симметрии. Факторы, определяющие антигенность. Крупные белки, имея большее число потенциальных детерминант, представляют собой лучшие антигены, по сравнению с небольшими. Чем больше отличается антиген от собственных молекул организма, индуцирующих Толерантность, тем он более эффективен при индукции иммунного ответа. Те участки пептидной цепи, которые далеко выступают за пределы компактной структуры молекулы, обычно представляют собой области большого скопления эпитопов. Наименьший вклад в антигенность вносят те участки поверхности молекулы, которые расположены вблизи ее впячиваний, где находятся прочно закрепленные молекулы воды. Для формирования обширной области контакта между антигеном и антителом способность антигена к изменению формы играет, по-видимому, большую роль, поскольку позволяет ему принять такую конформацию, которая обеспечивает наибольшую степень взаимодействия с антителом. Полагают, что энергия, затрачиваемая на такие конформационные изменения, с избытком окупается изменением внутренней свободной энергии, которое происходит при возникновении новых участков связывания. Этот приток энергии, обеспечивающий конформационные изменения, приводящие к прочному связыванию, видимо, позволяет... [стр. 191 ⇒]

Методы определения антител и антигенов основаны на различных способах регистрации их взаимодействия. С некоторой степенью условности их можно разделить на 3 группы: — методы, основанные на реакции преципитации; — методы, основанные на реакции агглютинации; — методы, основанные на использовании меченых антител или антигенов. Методы, основанные на реакции преципитации. За счет мультивалентности антител и антигена при их смешивании образуется так называемая решетка, которая может содержать антиген и антитела в разных пропорциях. На основе реакции преципитации разработаны различные количественные методы. Двойная диффузия в агаре по Оухтерлони. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, помещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Если анализу подвергается смесь антигенов, то образуется несколько линий преципитации. Если соседние лунки содержат один и тот же антиген, то линии преципитации сливаются. Если антигены разные, то образуется либо так называемая шпора, что свидетельствует о частичном родстве антигенов, либо, в случае неродственных антигенов, линии преципитации будут пересекаться. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. Этот метод отличается более высокой чувствительностью, чем предыдущий, так как антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует антиген. По мере удаления от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной концентрации антител в агаре. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем выше концентрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется несколько стандартов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки калибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах. Метод широко используется для определения концентрации иммуноглобулинов, C3-комплемента компонента, С-реактивного белка, а-фетопротеина, трансферрина. В Москве фирмой «Реафарм» выпускаются стационарные иммунодиффузионные планшеты для определения содержания иммуноглобулинов различных классов в крови или других биологических жидкостях. В табл. 11—13 приведены нормы показателей для этого метода. Таблица 11. Концентрация иммуноглобулинов (г/л) взрослого человека в сыворотке крови в норме («Реафарм») Иммуноглобулин... [стр. 39 ⇒]

Варианты осуществления иммуноферментного анализа принципиально те же, что и радиоиммунологического. Прежде всего это гомогенный и гетерогенный вари-анты. Гомогенный иммуноферментный анализ, который используют для определения низомолекулярных веществ, основан на различии активности фермента в зависимости от характера его связывания (например, подавление активности в результате связывания с гаптеном и восстановление ее после реакции антиген-антитело). При гетерогенном иммуноферментном анализе антиген или антитело иммобилизуется на твердой фазе. В качестве твердой фазы обычно используют пластик - лунки планшетов для иммунологических реакций. Основные варианты техники гетерогенного иммуноферментного анализа (техники ELISA): конкурентный тест с использованием меченых антигенов и антител и неконкурентные тесты, к которым относятся метод двойных антител (сэндвич- метод) и непрямой метод. Сущность метода двойных антител состоит в следующем. Антитела фиксируют на твердой фазе, для чего инкубируют их в лунках планшета из полистирола с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Затем в лунки добавляют растворы анализируемого или стандартного антигена, инкубируют, отмывают. После отмывки в лунки приливают избыток меченных ферментом антител (эти антитела должны принадлежать к животному другого вида, чем иммобилизованные), несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием. На последнем этапе анализа в лунки добавляют субстрат, который под влиянием фермента превращается в окрашенный продукт реакции. Количество этого продукта (а значит, и интенсивность окраски) пропорци-онально количеству связавшихся с антигеном конъюгатов антитело - фермент. Степень окраски раствора измеряют фотометрически (используя специальные спектрофотометры, позволяющие измерять поглощение света в пробах, находящихся непосредственно в планшетах). Для определения антител часто используют непрямой метод, смысл которого состоит в том, что в лунках иммобилизуют антиген, затем инкубируют его с пробой, содержащей исследуемые антитела, затем, после отмывки, обрабатывают конъюгатом антиглобулин-фермент, после чего добавляют субстрат и измеряют количество продукта реакции. Иммуноферментный метод в основном соответствует радиоиммунологическому по чувствительности и возможностям использования. Вместе с тем он обладает рядом весьма существенных преимуществ: коньюгаты белка с ферментами более стабильны, чем изотопная метка, поэтому их можно хранить более длительное время; использование ферментной метки исключает необходимость применения мер предосторожности, как при изотопной метке; наконец, изменение окраски субстрата можно наблюдать не только фотометрически, но и визуально (полуколичественный метод), т.е. не требуется дорогостоящих счетчиков радиоактивности. Создание коммерческих автоматизированных систем для проведения иммуноферментного анализа и наборов высокоспецифических реагентов открыло широкие возможности его практического использования. [стр. 90 ⇒]

1. Реакции антиген—антитело Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального pH среды). Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром /^-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum — сыворотка и logos — учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изу... [стр. 281 ⇒]

Иммунодиагностические реакций и их применение ген—антитело (реакция связывания комплемента, радиального гемолиза и др.). Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы. 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним, В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (.реакция Вассермана). Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че... [стр. 287 ⇒]

ГЛАВА 13. Иммунодиагиостические реакции и их применение ген-антитело (реакция связывания комплемента, радиального гемолиза и др.). Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента ком плексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то ком племент остается свободным (рис. 13.8). РС К проводят в две фазы; 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сиф илиса (реакция Вассермана). Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки теля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че... [стр. 288 ⇒]

Лабораторное занятие № 6 Взаимодействие антиген-антитело и методы его регистрации: реакции антиген-антитело, не дающие визуальных феноменов Цель работы: изучить методические подходы для исследования образования комплекса антиген-антитело при невозможности образования агглютинации и преципитации иммунными комплексами. Оборудование, приборы, принадлежности: термостат, холодильник, центрифуга, автоматические дозаторы на разные объѐмы и наконечники к ним, 96-лучноные планшеты или стрипы, исследуемые образцы сыворотки крови, наборы для ИФА-определения антигенспецифических антитител, демонстрационные наборы для проведения РИА, демонстрационная РСК. I. Теоретическая часть Помимо антигенов с несколькими антигенными детерминантами, имеются и антигены с одной антигенной детерминантой. Такие антигены (а значит, и антитела к ним) невозможно выявить визуально по феноменам агглютинации и преципитации. Для выявления таких антигенов и антител длительное время применялась реакция связывания комплемента (РСК).Еѐ возможности ограничены, однако, классовой принадлежностью определяемых антител, которые должны принадлежать только IgM и IgG, то есть тем классам, которые обладают способностью инициировать классический путь активации системы комплемента. РСК представляет собой одну из классических реакций серологического метода. Это означает ограничение по разрешающей способности: в серологических реакциях возможно определение антител или антигенов при их концентрации в исследуемом материале не менее мг/л или мкг/л в то время. В отношении более низких концентраций серологические реакции неэффективны. РСК относится к сложным многокомпонентным серологическим реакциям. При постановке РСК in vitro создаются 2 системы: 1 - диагностическая, 2 – индикаторная. 1 - диагностическая система включает антиген (диагностикум), исследуемую сыворотку крови пациента, содержащую или несодержащую искомые антитела и комплемент. Все три ингредиента смешиваются в определенных пропорциях и инкубируются. Во время инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-комплемент в том случае, если в исследуемой сыворотке крови пациента присутствуют антитела к антигенудиагностикуму. При отсутствии антител комплемент остается свободным, и иммунные комплексы антиген-антитело-комплемент не образуются. Внешне образование иммунных комплексов не проявляется никакими феноменами. Для индикации образования иммунных комплексов, т.е. для регистрации 34... [стр. 34 ⇒]

Учитывая, что обычное антитело имеет два антигенсвязывающих участка и антиген может иметь несколько повторяющихся антигенных детерминант, общую силу связывания всего антигена с антителом приходится выражать таким понятием, как авидность. Следует помнить, что реально аффинность антител можно определить только при использовании моновалентных антигенов, чаще всего гаптенов. Поэтому для характеристики содержащих антитела суспензий или сывороток чаще применяется термин «авидность». Авидность также называют суммарным выражением аффинности, однако необходимо учитывать, что ее значение не является арифметической суммой аффинитетов. По мере возрастания числа эффективных контактов между антигеном и антителом вероятность диссоциации комплекса антиген–антитело при разрыве связей между эпитопом и паратом падает, поскольку для его распада необходимо одномоментное расхождение всех эпитопов и паратопов. Поэтому при одинаковой аффинности авидность димера (например, секреторного IgА) будет превышать авидность мономера (сывороточного IgА) по отношению к четырехвалентному антигену более, чем в два раза. Анализируя взаимодействие антиген–антитело, можно отметить несколько особенностей. 1) Оно может реализоваться только в среде электролитов, поскольку часть описанных выше связей между эпитопом и паратопом возникают только в условиях, обеспечивающих формирование несущих заряды поверхностей. Во внутренней среде организма животных такие условия реально присутствуют, но при постановке реакций антиген-антитело in vitro это необходимо учитывать. 2) Оптимальной концентрацией ионов солей для таких реакций является концентрация 0,85 %, а ионная сила растворов должна быть в пределах 0,5–0,1. Значительное повышение концентрации солей приводит к распаду комплексов антиген–антитело, в частности, 15 % раствор NaCl используют для получения компонентов реакции в свободном состоянии. 3) Не нарушающие силу связывания значения рН попадают в интервал 6,4–8,6. При изменениях рН до значений более 9,0 или менее 5,0 происходит сдвиг реакции в сторону диссоциации комплексов, что также используется при элюции антител или антигенов. 4) Оптимальной для взаимодействия температурой является 37ºС, но образование комплексов антиген-антитело происходит и при более низких температурах достаточно эффективно. Например, ориентировочные реакции агглютинации ставят при комнатной (18-20ºС) температуре. По114... [стр. 115 ⇒]

Считается, что температурный параметр реакции в большей степени зависит от антител, чем от антигенов, поскольку у млекопитающих, и в частности у человека, выявлены так называемые холодовые антитела. Они взаимодействуют с антигенами только при температурах ниже 37ºС и могут служить причиной развития гемолитической анемии, если являются аутоантителами. 5) При постановке реакций антиген–антитело in vitro видимые результаты реагирования проявляются не сразу после смешивания растворов реагентов, а по истечении определенного времени. В связи с этим реакцию антиген–антитело условно разделяют на фазу взаимодействия и фазу проявления. Условность такого разделения заключается в том, что собственно взаимодействие между паратопом и эпитопом при их правильном расположении друг относительно друга осуществляется мгновенно, однако до фазы проявления может проходить от нескольких минут до нескольких суток. Следует также помнить, что в зависимости от свойств и концентраций взятых в реакцию антител и антигенов проявление результатов взаимодействия может существенно различаться. Наиболее показательными в плане визуализации являются реакции агглютинации и преципитации, при которых образуются фиксируемые невооруженным взглядом агрегаты, состоящие из множества единиц антигенов и антител. Их образование и выпадение в осадок определяется, прежде всего, наличием в молекуле антитела как минимум двух антигенсвязывающих участков. В свою очередь участвующий в реакциях антиген должен иметь более чем одну антигенную детерминанту. Если эти два условия имеются, время и степень визуализации будут зависеть от концентраций реагентов, размеров несущих антигенные детерминанты частиц и однородности взятых в реакцию антител. Собственно феномен агглютинации (преципитации) заключается в следующем. При случайных столкновениях антигенов и антител в растворе возможны ситуации, когда одна молекула антитела присоединяется одним из своих антигенсвязывающих участков к антигенной детерминанте на одной антигенной частице, а вторым – к такой же, но находящейся на другой частице. Тем самым две такие антигенные частицы оказываются связанными в агрегат. Поскольку антигены в таком агрегате поливалентны, возможны реализующиеся по такой же схеме взаимодей115... [стр. 116 ⇒]

Характер выпадающего осадка, прежде всего, зависит от свойств антигенной частицы. Чем большие она имеет размеры, тем короче будет фаза взаимодействия и тем более выраженным будет осадок. Кроме того, важным является количество доступных для связывания антигенных дерминант. При наличии двух детерминант образуются агрегаты в виде цепочек или небольших колец (слабо видимый, медленно образующийся осадок). При увеличении количества детерминант возрастает вероятность образования агрегатов в виде трехмерных решеток (сеток), имеющих гораздо большие размеры. Соответственно скорость образования и выраженность осадков увеличиваются. Существенным для проявления результатов агглютинации и преципитации является и состав участвующих в реакции антител. Если суспензия антител включает антитела различной специфичности, а антиген имеет несколько разновидностей комплементарных этим антителам антигенных детерминант, вероятность образования осадков возрастает. Поэтому так называемые поликлональные антитела, получаемые из сывороток иммунизированных конкретным поливалентным антигеном животных, являются более предпочтительными в подобных реакциях, чем обладающие только одним типом специфичности моноклональные антитела. Кроме того, в каждой конкретной реакции проявляется влияние относительных количеств (концентраций) взаимодействующих агентов (ил. 47). При избытке любого из них вероятность образования агрегатов падает, поэтому кривая, графически отображающая изменение количества осадка в зависимости от концентраций антигенов или антител, имеет форму параболы. Соотношение концентраций антигенов и антител, при котором количество осадка максимально, называется точкой эквивалентности реакции. Минимальные и максимальные значения соотношений антиген : антитело, в пределах которых еще образуются видимые глазом осадки, определяют так называемую зону эквивалентности. Все описанные выше особенности в равной мере касаются и агглютинации и преципитации, поскольку принципиальных различий между ними нет. Применение этих двух терминов сложилось исторически и сохраняется, скорее, как дань традициям. Агглютинацией принято считать осаждение антителами корпускулярных антигенов (клеток, вирусных частиц или состоящих из множества молекул их фрагмен... [стр. 117 ⇒]

Естественно, что при применении таких сывороток для идентификации выделенного антигена (например, конкретных болезнетворных бактерий) или обнаружения его в исследуемом материале перекрестные реакции явно нежелательны. В связи с этим еще на заре применения сывороток для идентификации бактерий и диагностики инфекционных заболеваний был предложен до сих пор используемый метод улучшения их качества. Так называемые моноспецифические сыворотки или, как их традиционно называют до сих пор, антисыворотки («анти» в данном контексте обозначает «против конкретного антигена», например, антисыворотка холерная, позволяющая отличить холерного вибриона от других бактерий) получают путем истощения или адсорбции (ил. 44. 1). Для этого сыворотку смешивают с антигеном, дающим нежелательную перекрестную реакцию, в условиях, обеспечивающих взаимодействие антиген–антитело, и полученные комплексы отделяют от раствора, например центрифугированием. Антител в сыворотке становится меньше (она истощается), но за счет адсорбции антигеном дающих нежелательную перекрестную реакцию антител специфичность сыворотки по отношению к нужному антигену нарастает. Используя по такой схеме последовательно несколько родственных антигенов, можно достичь нужного уровня специфичности сыворотки. Однако при истощении на каждом этапе происходит уменьшение общего объема сыворотки при удалении получаемых осадков, поэтому адсорбцию обычно проводят лишь несколько раз. Кроме того, такой прием не освобождает сыворотку от других, так называемых балластных, антител. В связи с этим с появлением в химии колоночной аффинной хроматографии был разработан метод получения суспензий антител одинаковой специфичности из поликлональных сывороток (ил. 44. 2). Основой метода является обратимость реакций антиген–антитело. Хроматографическую колонку заполняют гранулами несорбирующего белки вещества, с которым ковалентно связаны молекулы конкретного антигена. Затем через колонку пропускают раствор электролитов, обеспечивающий условия связывания антигенов и антител и далее смесь такого раствора с сывороткой. По мере прохождения через колонку на заполняющем ее веществе будут осаждаться только специфичные по отношению к выбранному антигену антитела. После прохождения всего объема раствора, содержащего сыворотку, колонку промывают несколькими объемами исходного раствора электролитов для полного удаления всех несвязавшихся антител. Последним этапом является пропускание через 121... [стр. 122 ⇒]

Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций является двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, расположенные на расстояниях 4–10 мм друг от друга, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и антитела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммунодиффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу. Результаты учитывают каждые 24 часа в течение 6–7 суток. Время образования преципитатов варьирует в зависимости от температуры инкубирования гелей (реакцию можно проводить при +4ºС, +18–20ºС или +37ºС) и от молекулярной массы антигенов. Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным. Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини (ил. 48). Для постановки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое образуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими второй компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компонент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в силу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «радиальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки. При этом площадь занятой преципитатом ок129... [стр. 130 ⇒]

3. Афинность - прочность связи между эпитопом антигена и активным центром антител, зависит от их пространственного соответствия. 4. Авидность - интегральная характеристика силы связи между антигеном и антителами, с учетом взаимодействия всех активных центров антител с эпитопами. Поскольку антигены часто поливалентны, связь между отдельными молекулами антигена осуществляется с помощью нескольких антител. 5. Гетерогенность - обусловлена антигенными свойствами антител, наличием у них трех видов антигенных детерминант: - изотипические - принадлежность антител к определенному классу иммуноглобулинов; - аллотипические- обусловлены аллельными различиями иммуноглобулинов, кодируемых соответствующими аллелями Ig гена; - идиотипические- отражают индивидуальные особенности иммуноглобулина, определяемые характеристиками активных центров молекул антител. Даже тогда, когда антитела к конкретному антигену относятся к одному классу, субклассу и даже аллотипу, они характеризуются специфическими отличиями друг от друга (идиотипом). Это зависит от особенностей строения V- участков H- и L- цепей, множества различных вариантов их аминокислотных последовательностей. Понятие о поликлональных и моноклональных антителах будет дано в следующих разделах. Характеристика основных классов иммуноглобулинов. Ig G. Мономеры, включают четыре субкласса. Концентрация в крови- от 8 до 17 г/л, период полураспада- около 3- 4 недель. Это основной класс иммуноглобулинов, защищающих организм от бактерий, токсинов и вирусов. В наибольшем количестве IgG- антитела вырабатываются на стадии выздоровления после инфекционного заболевания (поздние или 7S антитела), при вторичном иммунном ответе. IgG1 и IgG4 специфически (через Fabфрагменты) связывают возбудителей (опсонизация), благодаря Fc- фрагментам IgG взаимодействуют с Fc- рецепторам фагоцитов, способствуя фагоцитозу и лизису микроорганизмов. IgG способны нейтрализовать бактериальные экзотоксины, связывать комплемент. Только IgG способны транспортироваться через плаценту от матери к плоду (проходить через плацентарный барьер) и обеспечивать защиту материнскими антителами плода и новорожденного. В отличие от IgM- антител, IgG- антитела относятся к категории поздних- появляются позже и более длительно выявляются в крови. 29... [стр. 29 ⇒]

Реакция двойной (встречной) иммунодиффузии по оухтерлони Сущность метода заключается в том, что антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу (зона диффузии не видна, так как не совпадает с зоной преципитации). Преципитация отмечается на границе зон диффузии антитела и антигена, поэтому и имеет вид полосы. Методика: на стекло (в чашку Петри) тонким слоем выливают растопленный агаровый или агарозный гель; после затвердевания в нем вырезают лунки (одна в центре, вокруг нее кольцевидно расположены остальные); в лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки (если исследуется антиген, известен состав сыворотки, и наоборот); чашки Петри с внесенными в лунки антигенами и иммунными сыворотками выдерживают в течение не менее двух суток во влажной камере; антигены и антитела диффундируют навстречу друг другу, в том месте, где они встречаются в эквивалентных соотношениях, образуется непрозрачный преципитат (белая полоса). Учет результатов: после инкубации слой геля просматривают в лучах отраженного света с помощью лупы, отмечают наличие и характер полос преципитации между лунками с антигеном и антителами. Чтобы усилить контрастность преципитата на фоне прозрачного агара, его окрашивают. Скорость диффузии антигенов обратно пропорциональна размерам их молекул, поэтому разные антигены диффундируют в агаре с различной скоростью и оказываются в момент встречи с соответствующими антителами в разных участках слоя геля. Образовавшийся преципитат одного вида не мешает антителам и антигенам других видов диффундировать. Если раствор содержит несколько антигенов, то образуется несколько зон преципитации, каждая в том месте, где антиген и антитело встретились. С помощью реакции встречной иммунодиффузии можно не только выявить антигены, но и изучить степень сходства между ними (реакция идентичности) и выявить состав антител в иммунной сыворотке. [стр. 87 ⇒]

В лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее – антигены). Антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу. В том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. Возможные результаты: полная неидентичность (линии преципитата пересекаются, так как антигены будут диффундировать с разной скоростью и полоса преципитации для каждого антигена будет образовываться в разных местах); частичная идентичность; полная идентичность антигенов (линии преципитата сливаются). Сфера применения: реакция двойной радиальной иммунодиффузии является полуколичественным методом (не очень чувствительна, но достаточно проста), может использоваться для скрининговых исследований (определение антител, в том числе аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам в реакции идентичности, и антигенов). Иммуноэлектрофорез – сочетание электрофореза и иммунопреципитации. Методика: расплавленный агаровый гель равномерно наливают на стекло; после затвердения в геле делают лунку; в лунку вносят смесь антигенов, производят их разделение с помощью электрофореза; в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку; антитела, содержащиеся в сыворотке, диффундируют в гель, а антигены – навстречу антителам (с того места, где они остановились во время электрофореза); там, где антитела встречаются с антигеном, образуются линии преципитации. Метод позволяет оценить лишь качественный состав исследуемой смеси белков. [стр. 88 ⇒]

Непрямая реакция иммунофлюоресценции Антигены тканей, микроорганизмы обрабатывают иммунными сыворотками. Антитела, не связавшиеся с антигенами, отмывают. Мазок обрабатывают антиглобулиновой сывороткой (антитела к антителам), меченной флюорохромами. Затем смотрят свечение под люминесцентным микроскопом. Достоинства непрямой РИФ: при использовании непрямой РИФ достаточно иметь одну меченую антивидовую сыворотку (содержит антитела к антителам), специфичные сыворотки (содержат антитела против антигена) не будут мечеными; более чувствителен, так как в результате первой реакции между антигеном и антителом увеличивается поверхность, связывающая антитела, меченные флюорохромом. Недостатки непрямой РИФ. Возрастает опасность неспецифической флюоресценции, поэтому для ее исключения необходимо поставить контроль: материал, в котором нет антигена, обработать сывороткой, содержащей антитела (к определяемому антигену и к антителам диагностической сыворотки; последние мечены флюорохромом) – результат должен быть отрицательным; материал, содержащий антиген, обработать сначала сывороткой без антител, а затем с антителами к антителам (мечены флюорохромами) – результат должен быть отрицательным. [стр. 94 ⇒]

C. тест на HBsAg и антитела к ним не применяется в данный момент. D. о естественно перенесенном заболевании E. об острой фазе заболевания 355. Метод количественного определения антител или антигенов, в котором используются антитела, меченые ферментом: А. ПЦР В. ИФА С. метод агглютинации D. метод Грама Е. метод коагглютинации 356. В основе ИФА лежит: A. реакция щелочей B. реакция кислот C. реакция антиген-антитело D. реакция на возбудитель E. реакция на изменение температуры 357. Назовите основные принципы ИФА: A. для выявления антигенов B. для выявления антител C. для выявления эритроцитов D. для выявления антигенов и антител E. для выявления элементов дермы 358. Для визуализации образовавшегося при ИФА иммунных комплексов используется: A. изотоп в качестве метки B. ферментная метка C. твердая фаза D. специфический реагент E. буферный раствор 359. Компоненты, не использемые при ИФА: A. взвесь лимфоцитов B. сыворотка крови C. специфический реагент на твердой фазе D. иммуносорбент E. буферный раствор 360. «Сэндвич» метод ИФА для обнаружения антигенов основан на: A. конкурентном связывании антител, связанных с твердой фазой, с меченым и определяемым антигеном B. участии двух антител C. участии двух антигенов D. участии 3-х компонентов: двух антител и одного антигена E. участии 3-х компонентов: двух антигенов и одного антитела 361. ИФА характеризуется: A. высокой чувствительностью B. воспроизводимостью C. практически отсутствуют интерферирующие факторы... [стр. 23 ⇒]

Простые серологические реакции. Укажите наиболее корректное утверждение: A. включают только два компонента - антиген и антитело B. протекают только в жидкой среде C. в реакционной смеси содержится 3 компонента D. могут представлять собой последовательности нескольких реакций E. реакция связывания комплемента 440. Иммуноэлектрофорез применяется для выявления: A. преципитинов B. макроорганизмов во внешней среде C. идентификации антигенов по их электрофоретической активности D. комплемента E. определения групповой принадлежности крови 441. Специфические антитела обнаруживаются в сыворотке крови после первичного контакта с антигеном A. через 10 мин B. через 1 ч. C. через 5-7 дней D. через 3-5 нед. E. через 3 часа 442. Препараты, содержащие известные антитела, применяемые для определения вида микроорганизма A. бактериофаги B. аллергены C. иммунные диагностические сыворотки D. диагностикумы E. анатоксины 443. Название диагностических сывороток, содержащих антитела только к одному антигену A. поливалентными B. аффинными C. монорецепторными D. моноклональными E. поликлональные 444. Ингредиенты реакции агглютинации в серологическом методе диагностики A. иммунная диагностическая сыворотка, сыворотка больного, электролит B. иммунная диагностическая сыворотка, чистая культура бактерий, электролит C. диагностикум, сыворотка больного, электролит D. иммунная диагностическая сыворотка, диагностикум, электролит E. иммунная сыворотка, аллерген, электролит 445. В серологическом методе диагностики определяют A. титр АГ B. титр АТ C. иммунные комплексы D. титр цитокинов E. абсолютное количество иммуноглобулинов... [стр. 35 ⇒]

Реакция агглютинации – это склеивание и осаждение корпускулярного антигена под действием антитела в присутствии электролита. Различают следующие модификации реакции агглютинации: 1) реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА); 2) латекс-агглютинацию; 3) ко-агглютинацию; 4) антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Самая распространенная реакция – РПГА. В ней один из компонентов (антиген или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса АТ – АГ склеиваются и выпадают в осадок. В латекс-агглютинации в качестве сорбента используют частицы латекса, а в ко-агглютинации – клетки золотистых стафилококков. Реакция Кумбса используется для выявления неполных антител. 2. Реакция преципитации – это осаждение антигена из раствора под действием антитела преципитирующей сыворотки в присутствии электролита. В реакции участвует растворимый антиген. 3. Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная, многокомпонентная непрямая реакция иммунитета. Включает в себя две системы: 1) исследуемую, состоящую из антигена и антитела (один из них неизвестен), в которую вносится также комплемент; 2) индикаторную, состоящую из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. Если в исследуемой системе антиген и антитело соответствуют друг другу, то они образуют комплекс, связывающий комплемент. В этом случае в индикаторной системе не произойдет изменений. Если же в исследуемой системе антиген и антитело не соответствуют друг другу, то комплекс АГ – АТ не образуется, комплемент остается свободным. Он связывается комплексом АГ – АТ индикаторной системы и тем самым обуславливает гемолиз эритроцитов. 4. Реакции с участием меченых антигенов или антител: 1) радиоиммунный анализ (РИА); основан на использовании меченных радиоактивным йодом или водородом антител. Образующийся комплекс АГ – АТ с радиоактивной меткой обнаруживается с помощью радиометров; 2) реакция иммунофлюоресценции; основана на том, что антитела иммунной сыворотки метят флюорохромами. Комплекс АГ – АТ обнаруживают при флюоресцентной микроскопии; 3) иммуноферментный анализ (ИФА); компонент реакции метят ферментом, который при положительном результате включается в комплекс АГ – АТ. При добавлении соответствующего субстрата происходит изменение окраски. 5. Реакция токсиннейтрализации (для определения типа токсина возбудителя). Смесь токсина и антитоксической сыворотки вводят белым мышам, и, если они соответствуют друг другу, т. е. нейтрализуются, мыши не погибают. 10.2. Иммунопрофилактика Иммунопрофилактика – это использование иммунологических закономерностей для создания искусственного приобретенного иммунитета (активного или пассивного). Для иммунопрофилактики используют: 1) антительные препараты (вакцины, анатоксины), при введении которых у человека формируется искусственный активный иммунитет;... [стр. 22 ⇒]

Освоить методику постановки реакции агглютинации (РА) классическим объемным (пробирочным) и капельным методами. Материалы и оборудование. Аппарат Флоринского для разлива сыворотки крови, пробирки агглютинационные (бактериологические) с ровным сферическим дном, пипетки градуированные на 1 и 5 мл, стерильные пастеровские пипетки и штативы, сыворотка крупного рогатого скота позитивная (бруцеллезная), сыворотка нормальная (здорового) крупного рогатого скота (часть пробирок с нормальной и позитивной сыворотками нумерована - шифр для исследования, другая часть для контроля остается под названием «позитивная» и «нормальная^», антиген для РА (единый бруцеллезн^хй), пробирки с физраствором КаС1, резиновые груши. Для демонстрации необходимы таблицы, пробирки с положительной и отрицательной РА, пробирки с кольцевой положительной и отрицательной реакцией с молоком (КР). Методические указания. В основе всех с е р о л о г и ч е с к и х р е а к ц и й лежит иммунологическое взаимодействие между антигенами и антителами, в результате чего образуется комплекс антиген - антитело. Антигены - генетически чужеродные вещества, которые при введении в организм животного (и человека) вызывают специфическую перестройку лимфоретикулярной ткани, сопровождающуюся продукцией (выработкой) антител. Различают антигены корпускулярные, или клеточные (бактерии, эритроциты), и растворимые (молекулярно- дисперсные). Антигены поливалентны - имеют несколько детерминант них рецепторов для связи с антителами и способны вступать в реакцию с ними как в организме животного (1п у1уо), так и вне организма - в пробирке (1п уИго). Антитела - высокомолекулярные белки глобулиновой фракции сыворотки крови (иммуноглобулины). По проявлению феномена взаимодействия между антигеном и антителами 1п уИго различают: осадочные (прямые) реакции, лизирующие и нейтрализующие. Антитела, участвующие в осадочных реакциях, получили название по своему взаимодействию с антигеном: • агглютинины - вызывают склеивание корпускулярного антигена агглютиногена и осаждение комплекса антиген - антитело (агглютината); • преципитины - образуют преципитат с растворимым антигеном преципитиногеном. В реакциях лизиса участвуют антитела бактериолизины и гемолизины, обусловливающие распад корпускулярного антигена. Нейтрализующие антитела обезвреживают токсическое действие антигена (токсина). Осадочные серологические реакции протекают в две фазы: • первая фаза - специфическая, невидимая простым глазом, при ней происходит образование комплекса антиген - антитело, • второй фазе - неспецифической (физико-химической) - проявляется конечный эффект - видимый результат, осаждение агглютината. Иммунологические метода: используются как для выявления количества или титра антител в сыворотке крови (серодиагностика), так и для обнаружения антигенов в биологических жидкостях (индикация). [стр. 19 ⇒]

Серологические реакции для выявления антигенов и антител Данная группа иммунологических реакций оказалась исключительно удобной, как для исследования любых сложных смесей антигенов, так и для обнаружения антител к ним. Первоначально эти реакции были использованы для диагностики инфекционных болезней, а также в микробиологической практике. Высокая чувствительность и специфичность серологических реакций обусловили их широкое применение в биологии и медицине. Эти реакции можно охарактеризовать как процесс взаимодействия антигенов с антителами, протекающий in vitro и имеющий ряд особенностей: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность. Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с pH, близким к нейтральному при t – 37 С. Связь между антигеном и антителом в образовавшемся комплексе прочная, но обратимая. Комплексы антиген-антитело могут диссоциировать на составные компоненты без изменения свойств. Диссоциация усиливается при снижении pH до 2-3 и повышении pH до 9.0 и более. Реакции протекают в две фазы: 1) специфическая – фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител и эпитопов антигена; обычно эта фаза длится несколько секунд или минут; 2) неспецифическая – фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов; может развиваться от нескольких минут до нескольких часов (в среднем – 30 мин). Реакции антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов – агглютинации, преципитации, лизиса. Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размеры частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура). Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена, реагируя со свободными детерминантами и 126... [стр. 126 ⇒]

В результате формируются сетевые решетчатые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении. Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антииммуноглобулинов (см. реакцию Кумбса). В серологических реакциях обычно решается две задачи: 1) с помощью известной антисыворотки в биологических жидкостях выявляют антиген; 2) с помощью известного антигена в сыворотке крови определяют антитела. Для выявления неизвестного антигена (микроорганизма, белка и др.) используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами. Обнаружение антител проводят с использованием специальных антигенов – иммунодиагностикумов. Часто это взвесь известных убитых (инактивированных) микроорганизмов. При выделении из клеток различных антигенов используют методы разрушения, экстракции, обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирование. Реакции агглютинации В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок. В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации и т.д. Для диагностики инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух вариантах: определяют вид выделенного от больного микроба-возбудителя с помощью 127... [стр. 127 ⇒]

Реакции иммунитета Это реакции между антигеном и антителом, которые происходят в живом организме, а также могут быть воспроизведены в лабораторных условиях. Реакции антитела и антигена называются серологическими, или гуморальными. В процессе взаимодействия с антигеном участвует не вся молекула иммуноглобулина, а лишь ее ограниченный участок — антигенсвязывающий центр. Антитело взаимодействует не со всей молекулой антигена сразу, а только с ее антигенной детерминантой. Антитела обладают специфичностью взаимодействия, т. е. связываются со строго определенной антигенной детерминантой. К особенностям антител относится их аффинность и авидность. Аффинность — это сила специфического взаимодействия антитела с антигеном (энергия их связи). Эта характеристика зависит от степени соответствия структуры антигенсвязывающего центра и антигенной детерминанты. Чем больше они подходят друг другу, тем больше образуется межмолекулярных связей и тем выше будет устойчивость образовавшегося иммунного комплекса. В макроорганизме с одной и той же антигенной детерминантой способно одновременно прореагировать и образовать иммунный комплекс около 100 различных клонов антител. Все они будут отличаться структурой антигенсвязывающего центра и аффинностью. Авидность — это прочность связывания антигена с антителом. Она определяется аффинностью и числом антигенсвязывающих центров. При равной аффинности наибольшей авидностью обладают антитела класса М, так как они не имеют 10 антигенсвязывающих центров. Эффективность взаимодействия антитела с антигеном зависит от различных условий: pH среды, температуры, осмотической плотности, солевого состава среды и т.д. Наиболее приемлемыми для реакции антиген—антитело явля118... [стр. 124 ⇒]

Смотреть страницы где упоминается термин "антиген и антитело": [280] [26] [38] [372] [56] [135] [135] [3] [5] [22] [58] [61] [265] [13] [146] [399] [200] [34] [48] [52] [6] [27] [64] [242] [46] [67] [139] [75] [86] [89] [95] [120] [229] [179] [19] [20] [20] [114] [117] [81] [160] [6] [16] [51] [15] [4] [4] [227] [230] [238]